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琼脂糖水平电泳槽

琼脂糖水平电泳槽实验操作

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1. 根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶缓冲液。一般为  1× TAE或0.5×TBE。

注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的。

2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉。

注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。

3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖

注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。微波炉中加热时间不宜过长。

注意：EB是一种致癌物质。使用含有EB的溶液时，请戴用手套。EB在可见光下会分解。

5.将琼脂糖溶液倒入制胶托盘中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在5－8 mm 之间。

注意：不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会使得水分

过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。

6.在室温下使胶凝固（大约30 分钟），然后放置于电泳槽中进行电泳。

注意：凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4℃下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存2～5 天。

蛋白凝胶电泳的分类

蛋白凝胶电泳分为非变性凝胶和变性凝胶

所谓非变性凝胶，即在凝胶中不加SDS和尿素等变性剂，这种凝胶中，蛋白质仍保持活性，其迁移率受它的静电荷与分子大小两个因素的影响。因此在非变性凝胶中进行电泳是不能测得分子量的，常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。

所谓变性凝胶，即在凝胶中加入变性剂，如尿素、SDS(十二烷基磺酸钠)、DTT等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构，把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。蛋白质在这种变性凝胶中的迁移率与它们分子量的对数成直线关系。因此利用变性凝胶进行电泳可以测得蛋白质的分子量。目前应用较多的变性剂为SDS。

SDS-PAGE电泳

蛋白质在SDS-PAGE电泳中，迁移率只和其分子量相关

PAGE据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；不连续系统电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好。不连续的凝胶作为支持介质，利用凝胶层的不连续性、缓冲液离子的不连续性、PH的不连续性及电位梯度的不连续性，使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，然后进行分离。