核酸电泳凝胶的摄影与净化处理

核酸电泳凝胶的摄影与净化处理

1.凝胶摄影

需配置分辨率较高的照相机，照相机固定架，近摄镜和红色滤光镜以及有机玻璃防护面罩。

操作需在暗室进行，将相机固定好，把凝胶放在紫外检测仪上适当位置，调焦，装上红色滤光片，按常规拍照。

亦可使用凝胶自动处理系统，但仪器费用较高。

2.EB溶液的净化处理

由于EB具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。

(1) 对于EB含量大于0.5μg/ml的溶液，可如下处理:

①将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5μg/ml;

②加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4 ，混匀，再加入等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时;

③加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。

(2) EB含量小于0.5μg/ml的溶液可如下处理:

① 按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时;

② 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。

电泳技术原理（以琼脂糖凝胶电泳为例）

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首先介绍使用的载体--琼脂糖。

琼脂糖是线性的多聚物，基本结构是1,3连结的β-D-半乳呋喃糖和1,4连结的3,6-脱水α-L-半乳呋喃糖。琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物。琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶，这是它具有多种用途的主要特征和基础。琼脂糖凝胶性能通常用凝胶强度表示。强度越高，凝胶性能越好。目前，PAGE连续体系应用也很广，虽然电泳过程中无浓缩效应，但利用分子筛及电荷效应也可使样品得到较好的分离，加之在温和的pH条件下，不致使蛋白质、酶、核酸等活性物质变性失活，也显示了它的优越性。质量较好的琼脂糖强度通常在1200克/cm2以上（1%胶浓度）。

电泳技术与病毒

不同大小的蛋白质和核酸可以通过聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳分离开来。在多数电泳技术中，每一种蛋白质或者核酸会形成一个条带。电泳技术的原理在于不同分子量的分子在凝胶中移动速率不同。将大小未知的蛋白质或者核酸分子在凝胶中的位置与相同凝胶中大小已知的分子比较，就能估计未知分子的大小。SDS-PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶中在SDS去污剂存在情况下屏蔽掉蛋白质带电不同，从而估计蛋白质分子量。在生理条件下，DNA分子糖-磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态，故DNA实际上呈多聚阴离子状态，在电场中向正极方向迁移。

复杂的病毒成分可以按照双向电泳进行分离，即先按照蛋白质等电点进行分离（等电聚焦电泳），再依据蛋白质分子量进行第二向的分离（SDS-PAGE）。

核酸或者蛋白质经过电泳分离的谱型可以通过将其从凝胶上转移（印迹）到一层固相膜上。如果转移的是DNA，就叫sourthern印迹技术，用以纪念它的发明者Edwin Southern；因此，它们在凝胶电泳中的迁移率主要取决于其大小（结构可比较时）（详细了解核酸结构如何影响迁移）。如果是RNA分子，就叫Nouthern blot，如果是蛋白质分子就是Western Blot。